師兄師兄，反轉(zhuǎn)錄真的好簡(jiǎn)單啊，操作說(shuō)明都只有豆腐大一塊，提RNA的有兩三頁(yè)呢！

是不是覺(jué)得組分一加、模板一加，上機(jī)，so easy？

是啊是啊，就這我還能出錯(cuò)？

哦，這么自信？那我考考你，反轉(zhuǎn)錄體系組成都有哪些？

這個(gè)我知道！酶、buffer、引物、模板RNA、無(wú)酶水！

可以的嘛，現(xiàn)在大多試劑盒都提供預(yù)混Mix了，我們只需要加引物、模板、水就可以了。那么，模板用量是多少你知道不？

…隨便加點(diǎn)？

這？！…要不要去基因組RNA？

要，…還是不要？

算了吧你…來(lái)，師兄給你好好說(shuō)說(shuō)。

一般來(lái)說(shuō)，反轉(zhuǎn)錄模板RNA添加量要嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書建議用量添加，過(guò)多會(huì)抑制反轉(zhuǎn)錄效率，過(guò)少會(huì)使下游PCR、qPCR實(shí)驗(yàn)cDNA模板量過(guò)低。而且，要注意根據(jù)提取純化的RNA濃度調(diào)整添加體積哦。

如果你下游實(shí)驗(yàn)為qPCR，可以使用福際生物的RT Easy II，這個(gè)是qPCR專用第一鏈cDNA合成試劑盒，預(yù)混了優(yōu)化配比的Oligo(dT)引物與隨機(jī)引物，可以省略添加引物的步驟。

但你的研究樣本是miRNA，就要根據(jù)說(shuō)明書建議量添加你自己合成的特異性引物。

哦，我明白了。那我做的是RNA，怎么又扯上基因組DNA了呢？

傳統(tǒng)方法提取RNA的過(guò)程中極易混入少量基因組DNA，因此在后續(xù)檢測(cè)過(guò)程中有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，會(huì)影響對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。這時(shí)你就要考慮去除殘留的基因組DNA。

可以設(shè)置無(wú)反轉(zhuǎn)錄對(duì)照（no-RT control）——即含有除反轉(zhuǎn)錄酶以外的所有成分——來(lái)確定是否存在基因組DNA干擾。

要避免殘留基因組DNA對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，可以在提取時(shí)使用DNA去除效果好的福際總RNA提取試劑盒；或者使用去基因組的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品，比如福際的RT Easy II (with gDNase)。還有一種方法是設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物，也可以達(dá)到避免基因組DNA干擾的目的。

哦，原來(lái)反轉(zhuǎn)錄還有這么多坑，謝謝師兄，我去做實(shí)驗(yàn)了~