產(chǎn)品介紹

試劑盒提供的2× Blue Real PCR Easy? Mix-SYBR是一種使用SYBR Green I進行Real Time PCR擴增反應的全新預混系統(tǒng)，能大幅度提高產(chǎn)物特異性和反應靈敏度。同時，提供ROX作為內(nèi)參染料。該試劑盒的熒光強度為同類產(chǎn)品的3-5倍，能更靈敏的、更直觀的反應目的模板DNA的濃度。

2× Blue Real PCR Easy? Mix-SYBR包含抗體法修飾的熱啟動酶Foreasy HS Taq DNA Polymerase，該酶相對于普通Taq酶具有擴增效率高、特異性擴增能力強、錯配率低等優(yōu)點；同時還包含藍色指示劑，便于移液示蹤，有效減少移液錯誤。

運輸及儲存條件

1.     運輸條件：全程低溫冰盒運輸。

2.     保存條件：避光保存于-20℃；若頻繁使用，也可置于4℃短期保存(限10天內(nèi)用完)。

試劑盒內(nèi)容

2× Blue Real PCR Easy? Mix-SYBR：包含抗體修飾的熱啟動酶Foreasy HS Taq DNA Polymerase、MgCl2、優(yōu)化配比的dNTPs和SYBR Green I、反應緩沖液、PCR反應增強劑、優(yōu)化劑、穩(wěn)定劑以及指示劑等。PCR反應時，只需將適當?shù)哪０?、引物、DNase-ddH2O添加到2× Blue Real PCR Easy? Mix-SYBR中即可用于PCR反應。

ROX Reference Dye：一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR擴增儀上，用于調(diào)整PCR加樣誤差所引起的 PCR管與管之間的差異。不同儀器所需ROX Reference Dye濃度不同，用戶可以根據(jù)儀器的推薦濃度添加。

DNase-Free ddH2O：超純水，用于補齊擴增體系剩余體積。

試劑盒原理

試劑盒使用了熱啟動Foregene Taq DNA Polymerase進行PCR擴增，通過檢測反應液中SYBRGreen I的熒光強度，達到監(jiān)控PCR產(chǎn)物擴增量的目的。在PCR反應體系中，加入過量SYBRGreen I熒光染料，SYBR Green I熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBRGreen I染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBRGreen I與雙鏈DNA結合后發(fā)出熒光，可以通過檢測反應體系中的SYBRGreen I熒光強度，達到檢測PCR產(chǎn)物擴增量的目的。

Real Time PCR引物設計原則

Forward Primer和Reverse Primer

進行Real TimePCR，引物設計非常重要。引物關系到PCR擴增的特異性、高效性等，可以參照以下原則進行引物設計：

u  引物長度：18-30bp。

u  GC含量：40-60%。

u  Tm值：引物設計軟件，如Primer 5，可以給出引物的Tm值。上下游引物的Tm值應    盡量接近。也可以使用Tm計算公式：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。進行PCR時，一般選擇低于引物Tm值5℃的溫度作為退火溫度（相應的提高退火溫度可以增加PCR反應的特異性）。

u  引物及PCR產(chǎn)物：

v  設計引物PCR擴增產(chǎn)物長度最好在100-150bp。

v  應盡量避開在模板的二級結構區(qū)域設計引物。

v  避免上下游引物3’端之間形成2個或2個以上的互補堿基。

v  引物3’端堿基不能存在多余3個連續(xù)的G或C。

v  引物自身不能存在互補結構，否則會形成發(fā)夾結構，影響PCR擴增。

v  引物序列中ATCG應盡量分布均勻，3’端堿基避免為T。