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熒光定量PCR試劑盒-SYBR Green I染料法

獨(dú)特的PCR優(yōu)化體系，使2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR具有更強(qiáng)的兼容性。

熱啟動(dòng)Foregene Taq Polymerase，具有更高的擴(kuò)增效率、更高的擴(kuò)增靈敏度、更高的擴(kuò)增特異性。

優(yōu)化的2× Real PCR EasyTM Mix使SYBR Green I具有更高的檢測(cè)靈敏性，其熒光強(qiáng)度為同類產(chǎn)品的3-5倍，可滿足不同類型的熒光定量實(shí)驗(yàn)需求。

本產(chǎn)品附帶有ROX內(nèi)參染料，可用于消除信號(hào)本底及孔間信號(hào)誤差，方便客戶用于不同型號(hào)定量PCR儀使用。

產(chǎn) 品 名 稱

熒光定量PCR試劑盒-SYBR Green I染料法

Real Time PCR EasyTM-SYBR Green I

貨    號(hào)

QP-01012

QP-01014

規(guī)    格

500 × 20 μL rxns

2000 × 20 μL rxns

價(jià)    格

￥827.00

￥2,648.00

描    述使用SYBR Green I進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)，能大幅度提高產(chǎn)物特異性和反應(yīng)靈敏度，熒光強(qiáng)度為同類產(chǎn)品的3-5倍。

產(chǎn)品介紹

Real Time PCR EasyTM-SYBRGreen I試劑盒提供的2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR是一種使用SYBR Green I進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)的全新預(yù)混系統(tǒng)，能大幅度提高產(chǎn)物特異性和反應(yīng)靈敏度。同時(shí)，提供ROX作為內(nèi)參染料。該試劑盒的熒光強(qiáng)度為同類產(chǎn)品的3-5倍，能更靈敏的、更直觀的反應(yīng)目的模板DNA的濃度。

2× Real PCR EasyTM Mix-SYBR包含本公司特有的熱啟動(dòng)ForegeneTaq DNA Polymerase，該酶相對(duì)于普通Taq酶具有擴(kuò)增效率高、特異性擴(kuò)增能力強(qiáng)、錯(cuò)配率低等優(yōu)點(diǎn)。用于熒光定量PCR反應(yīng)可減少非特異性擴(kuò)增，提高PCR的準(zhǔn)確性。


試劑盒應(yīng)用

熒光定量PCR進(jìn)行模板定量分析/常規(guī)PCR擴(kuò)增。


儲(chǔ)存條件

本試劑盒避光保存于-20°C；若頻繁使用，也可置于4°C短期保存(限10天內(nèi)用完)。

試劑盒內(nèi)容

2× Real PCR Easy? Mix-SYBR：包含福際生物特別改造的熱啟動(dòng)Taq DNA Polymerase、MgCl2、優(yōu)化配比的dNTPs和SYBR Green I、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑、優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑等。PCR反應(yīng)時(shí)，只需將適當(dāng)?shù)牧呀饣旌弦?、引物?/span>DNase-ddH2O添加到2× Real PCR Easy? Mix-SYBR中即可用于PCR反應(yīng)。

ROX Reference Dye：一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR擴(kuò)增儀上，用于調(diào)整PCR加樣誤差所引起的 PCR管與管之間的差異。不同儀器所需ROX Reference Dye濃度不同，用戶可以根據(jù)儀器的推薦濃度添加。

DNase-Free ddH2O：超純水，用于補(bǔ)齊擴(kuò)增體系剩余體積。


試劑盒原理

試劑盒使用了熱啟動(dòng)Foregene Taq DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過檢測(cè)反應(yīng)液中SYBRGreen I的熒光強(qiáng)度，達(dá)到監(jiān)控PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBRGreen I熒光染料，SYBR Green I熒光染料特異性地?fù)饺?/span>DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBRGreen I染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBRGreen I與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光，可以通過檢測(cè)反應(yīng)體系中的SYBRGreen I熒光強(qiáng)度，達(dá)到檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。

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Real Time PCR引物設(shè)計(jì)原則

Forward Primer和Reverse Primer

進(jìn)行Real TimePCR，引物設(shè)計(jì)非常重要。引物關(guān)系到PCR擴(kuò)增的特異性、高效性等，可以參照以下原則進(jìn)行引物設(shè)計(jì)：

u  引物長度：18-30bp。

u  GC含量：40-60%。

u  Tm值：引物設(shè)計(jì)軟件，如Primer 5，可以給出引物的Tm值。上下游引物的Tm值應(yīng)    盡量接近。也可以使用Tm計(jì)算公式：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。進(jìn)行PCR時(shí)，一般選擇低于引物Tm值5℃的溫度作為退火溫度（相應(yīng)的提高退火溫度可以增加PCR反應(yīng)的特異性）。

u  引物及PCR產(chǎn)物：

v  設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度最好在100-150bp。

v  應(yīng)盡量避開在模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域設(shè)計(jì)引物。

v  避免上下游引物3’端之間形成2個(gè)或2個(gè)以上的互補(bǔ)堿基。

v  引物3’端堿基不能存在多余3個(gè)連續(xù)的G或C。

v  引物自身不能存在互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，否則會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，影響PCR擴(kuò)增。

v  引物序列中ATCG應(yīng)盡量分布均勻，3’端堿基避免為T。

  • 無擴(kuò)增信號(hào)

    Answer

    1.    試劑盒保存不當(dāng)導(dǎo)致SYBR失效或者試劑盒過期導(dǎo)致SYBR熒光信號(hào)丟失。

    建議：試劑盒打開后，其中的試劑要避光-20℃保存，且不能經(jīng)常凍融；購買新的Real Time PCR Kit試劑盒進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

    2.    試劑盒中的Taq DNA Polymerase因試劑盒保存不當(dāng)或過期而失去活性。

    建議：確認(rèn)試劑盒的保存條件；重新在PCR體系中添加適量Taq DNA Polymerase或者購買新的Real Time PCR Kit試劑盒進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

    3.    DNA模板中存在大量的Taq DNA Polymerase的抑制因子。

    建議：重新純化模板或降低模板的使用量。

    4.    Mg2+濃度不適合。

    建議：我們提供的2× Real PCR Mix的Mg2+濃度為3.5 mM。但針對(duì)有些特殊的引物和模板可能需要的Mg2+濃度較高，因此可直接添加MgCl2進(jìn)行Mg2+濃度的優(yōu)化，建議每次增加0.5mM的Mg2+進(jìn)行優(yōu)化。

    5.    PCR擴(kuò)增條件不適合、引物序列或者濃度不當(dāng)。

    建議：確認(rèn)引物序列的正確性以及引物沒有降解；擴(kuò)增信號(hào)不好時(shí)，可嘗試降低退火溫度，適當(dāng)調(diào)整引物濃度等。

    6.    模板用量問題，太少或過多。

    建議：可進(jìn)行模板線性化梯度稀釋，選擇PCR效果最好的模板濃度進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)。


  • NTC出現(xiàn)過高的熒光值

    Answer

    1.    在操作過程中導(dǎo)致的試劑污染。

    建議：更換新的試劑進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)。

    2.    PCR反應(yīng)體系配制時(shí)發(fā)生污染。

    建議：操作時(shí)進(jìn)行必要的防護(hù)措施，比如：戴乳膠手套，使用帶濾芯的槍頭等。

    3.    引物出現(xiàn)降解，引物降解會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。

    建議：可使用SDS-PAGE電泳檢測(cè)引物是否降解，更換新的引物進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)。


  • 出現(xiàn)引物二聚體或非特異性擴(kuò)增

    Answer

    1.    Mg2+濃度不適合。

    建議：我們提供的2× Real PCR EasyTM Mix的Mg2+濃度為3.5 mM。但針對(duì)有些特殊的引物和模板可能需要的Mg2+濃度較高，因此可直接添加MgCl2進(jìn)行Mg2+濃度的優(yōu)化，建議每次增加0.5mM的Mg2+進(jìn)行優(yōu)化。

    2.    PCR退火溫度過低。

    建議：每次增加1℃或者2℃進(jìn)行PCR退火溫度的優(yōu)化。

    3.    PCR產(chǎn)物太長。

    建議：Real Time PCR產(chǎn)物長度最好在100-150bp之間，不要超過500bp。

    4.    引物出現(xiàn)降解，引物降解會(huì)導(dǎo)致很會(huì)飛特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。

    建議：可使用SDS-PAGE電泳檢測(cè)引物是否降解，更換新的引物進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)。

    5.    PCR體系不當(dāng)，或體系太小。

    建議：PCR反應(yīng)體系太小會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)精度降低。最好使用定量PCR儀推薦的反應(yīng)體系重新進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)。


  • 定量值重復(fù)性差

    Answer

    1.    儀器故障。

    建議：儀器的每一個(gè)PCR孔之間可能存在誤差，在溫度管理或檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生重現(xiàn)性較差現(xiàn)象。請(qǐng)根據(jù)相應(yīng)儀器的說明書進(jìn)行點(diǎn)檢。

    2.    樣品純度不好。

    建議：樣品不純會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差，這包括模板、引物的純度。最好進(jìn)行模板的再純化，引物最好使用SDS-PAGE純化。

    3.    PCR體系配制放置時(shí)間過長。

    建議：Real Time PCR體系配制好后立即用于PCR實(shí)驗(yàn)，不要擱置太長時(shí)間。

    4.    PCR擴(kuò)增條件不適合、引物序列或者濃度不當(dāng)。

    建議：確認(rèn)引物序列的正確性以及引物沒有降解；擴(kuò)增信號(hào)不好時(shí)，可嘗試降低退火溫度，適當(dāng)調(diào)整引物濃度等。

    5.    PCR體系不當(dāng)，或體系太小。

    建議：PCR反應(yīng)體系太小會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)精度降低。最好使用定量PCR儀推薦的反應(yīng)體系重新進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)。


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COA